I percorsi del museo (attualmente sono percorribili circa 12.000 metri quadrati) sono organizzati per piani.
Dal livello di piazza Duomo (4° livello) si accede alla zona monumentale con la chiesa della Santissima Annunziata, la Sagrestia Vecchia, il Palazzo Squarcialupi, la cappella della Madonna e quella del Manto. Da questa si entra nel Pellegrinaio con il celebre ciclo affrescato quattrocentesco, attraverso un luminoso atrio denominato Passeggio, su cui si aprono sale laterali, in passato destinate a corsie ospedaliere e oggi recuperate come spazi espositivi e museali.
Scendendo al livello inferiore (3° livello) si accede alla Corticella, vero e proprio snodo dei percorsi del Santa Maria, sulla quale si affacciano il Fienile medievale, dove è conservata la Fonte Gaia di Jacopo della Quercia, due confraternite laicali ricche di opere d'arte e ancora oggi attive: la Compagnia dei disciplinati sotto le volte dell'ospedale e la Compagnia di Santa Caterina della Notte e i suggestivi Magazzini della Corticella, dove da marzo 2011 sarà esposto il Tesoro di Santa Maria della Scala. Dalla Corticella si scende quindi ai cosidetti "labirinti" (1° livello) dove, lungo suggestivi cunicoli scavati nel tufo, sono ordinate le collezioni archeologiche.